ספקטרופוטומטרים הפכו למכשירים שגרתיים במעבדות ביולוגיה מולקולריות מודרניות. משמש לעתים קרובות לחומצה גרעינית, לכימות חלבונים וכימות ריכוזי צמיחה של חיידקים.
עיקרון פשוט של ספקטרופוטומטר
הספקטרופוטומטר משתמש במקור אור שיכול לייצר אורכי גל מרובים, ועובר דרך סדרה של מכשירים ספקטרוסקופיים ליצירת מקור אור באורך גל ספציפי. לאחר שמקור האור עובר דרך הדגימה לבדיקה, נספג חלק ממקור האור, ומחושב את ספיגת הדגימה ובכך מומר לריכוז מדגם. . ספיגת הדגימה פרופורציונאלית לריכוז המדגם.
כימות חומצות גרעין
הכימות של חומצות גרעין הוא התפקוד הנפוץ ביותר של הספקטרופוטומטר. ניתן לכמת Oligonucleotides, DNA חד-גדילי, DNA עם גדיל כפול ו- RNA במאגר. שיא הספיגה של שיא הספיגה הגבוה ביותר של חומצה גרעין הוא 260 ננומטר. ההרכב המולקולרי של כל חומצה גרעין שונה, ולכן גורמי ההמרה שונים. בכדי לכמת סוגים שונים של חומצות גרעין, בחרו במקדמים המקבילים מראש. לדוגמה, הקליטה של 1 OD תואמת 50 מיקרוגרם / מ"ל של dsDNA, 37 מיקרוגרם / מ"ל של ssDNA, 40 מיקרוגרם / מ"ל של RNA, ו -30 מיקרוגרם / מ"ל של אוליג. הספיגה לאחר הבדיקה מומרת על ידי המקדמים לעיל כדי להשיג את ריכוז המדגם המקביל. לפני הבדיקה, בחר את הנוהל הנכון, הזן את נפח תמיסת המניות והדילול ואז בדוק את פיתרון הריק והמדגם. עם זאת, הניסוי לא תמיד היה חלק. קריאות לא יציבות עשויות להיות כאב הראש הגדול ביותר עבור הנסיין. מכשירים עם רגישות גבוהה יותר מראים סחף גדול יותר בספיגה.
למעשה, עקרון העיצוב ועקרון העבודה של הספקטרופוטומטר מאפשרים לספיגה להשתנות בטווח מסוים, כלומר למכשיר יש דיוק ודיוק מסוימים. לדוגמה, הדיוק של ביופוטומטר אפנדורף הוא ≤1.0% (1A). תוצאות בדיקות מרובות כאלה משתנות בין כ- 1.0% מהממוצע והן תקינות. בנוסף, יש לקחת בחשבון גם את התכונות הפיזיקו-כימיות של החומצה הגרעינית עצמה ואת ה- pH של החיץ בו מומסת חומצת הגרעין, את ריכוז היונים וכו ': כאשר ריכוז היונים גבוה מדי במהלך הבדיקה, קריאות משמרות, לכן מומלץ להשתמש בערך pH מסוים ובריכוז יונים נמוך. חוצצים, כמו TE, מייצבים מאוד את הקריאות. ריכוז הדילול של הדגימה הוא גם גורם שאי אפשר להתעלם ממנו: בגלל נוכחות בלתי נמנעת של חלקיקים דקיקים, במיוחד דגימות חומצות גרעין, במדגם. נוכחותם של חלקיקים קטנים אלה מפריעה לתוצאות הבדיקה. על מנת למזער את השפעת החלקיקים על תוצאות הבדיקה, נדרשת ספיגת חומצת הגרעין להיות גבוהה לפחות מ- 0.1 A, והספיגה עדיפה בין 0.1 ל 1.5 A. בתוך טווח זה, ההפרעה של חלקיקים קטנים יחסית והתוצאה יציבה.
המשמעות היא שריכוז המדגם לא צריך להיות נמוך מדי או גבוה מדי (מעבר לטווח הבדיקה של הפוטומטר). לבסוף, גורמי ההפעלה, כמו ערבוב צריכים להיות מספיקים, אחרת ערך הספיגה נמוך מדי, אפילו ערכים שליליים; התערובת לא יכולה להתקיים בועות, לנוזל הריק אין חומר תלוי, אחרת הקריאה נסחפת בצורה דרסטית; יש להשתמש באותה קוביה לבדיקת הריק והמדגם אחרת, ההבדל בריכוז גדול מדי; גורם ההמרה ויחידת ריכוז המדגם נבחרים באופן עקבי; לא ניתן להשתמש בקובט עם בלאי חלון; נפח הדגימה חייב להגיע לנפח המינימלי הדרוש לקובט.
בנוסף לריכוז חומצות הגרעין, הספקטרופוטומטר מראה גם כמה יחסים חשובים מאוד המצביעים על טוהר הדגימה, כמו היחס של A 260 / A 280 המשמש להערכת טוהר הדגימה מכיוון ששיא הספיגה של החלבון הוא 280 ננומטר. מדגם טהור ביחס הגבוה מ- 1.8 (DNA) או 2.0 (RNA). אם היחס נמוך מ- 1.8 או 2.0, זה מצביע על נוכחות של חומרים חלבוניים או פנוולים. 230 מצביע על כך שישנם כמה מזהמים שנמצאים במדגם, כמו פחמימות, פפטידים, פנולים וכו ', והיחס בין חומצה גרעינית טהורה A 260 / A 230 גדול מ- 2.0. 320 מגלה את עכירות הפיתרון וגורמי הפרעה אחרים. עבור דגימות טהורות, A 320 הוא בדרך כלל 0.
Hangzhou Sumer מכשיר ושות 'בע"מ
הוסף: No.168 שד 'ווצ'אנג, מחוז Yuhang, האנגג'ואו 310023, סין
טל: 86-571-88739859
טלפון: +8618658504900
דוא"ל: info@sumerlab.com
אינטרנט: sumerinstrument.com