עיקור החיטוי כולל שלושה שלבים ברורים:
הסרת אוויר: בשלב ראשוני זה, החיטוי מסיר אוויר מהתא. משאבת ואקום שואבת את האוויר ויוצרת סביבה בלחץ נמוך. שלב זה מבטיח כי קיטור יכול לחדור לכל האזורים ביעילות ולהגיע לעומס לצורך עיקור מתאים.
עיקור: לאחר הוצאת האוויר, הטמפרטורה בתוך החיטוי מגיעה לרמה הנכונה. קיטור רווי, שנוצר תחת לחץ, הורג חיידקים, וירוסים ומיקרואורגניזמים אחרים. הטמפרטורה הרגילה לעיקור היא 121 מעלות בלחץ של 1.1 קילוגרם/סנטימטר רבוע (ק"ג/סמ"ר) (שווה ערך ל-15 פאונד/אינץ' רבוע (lb/in²)). משך החיטוי משתנה בהתאם לנפח העומס אך נחשב בדרך כלל ל-15-20 דקות.
קירור/ייבוש: לאחר עיקור, האדים משתחררים, והאוטוקלאב מתקרר. ברגע שהטמפרטורה בטוחה, הדלת נפתחת, והפריטים המעוקרים מוכנים לשימוש.
הסרת אוויר יעילה, מיקום נכון של פריטים וזמן חימום מתאים הם חיוניים לעיקור חיטוי מוצלח.